Nuove strategie per il rilevamento
del cancro con DNA libero circolante

di Clare Fiala & Eleftherios P. Diamandis

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Introduzione

Il DNA libero circolante (cfDNA), rilasciato da cellule normali e tumorali, è un nuovo biomarcatore di grande interesse. Il DNA tumorale circolante (ctDNA) contiene generalmente alterazioni genetiche che potrebbero risultare utili per l’individuazione del cancro. Diversi laboratori hanno riferito dati clinici interessanti, con sensibilità di rilevamento del cancro che vanno dal 50 al 70%, calcolate a specificità del 90-95%.1,2,3

Il ctDNA ha ulteriori applicazioni importanti, tra cui la prognosi, il monitoraggio della terapia e la stima del volume del tumore.4 Queste applicazioni sono meno controverse della diagnosi precoce del cancro e sono ampiamente utilizzate negli ambienti di ricerca. Nonostante i dati promettenti,1,2,3 sussistono grossi dubbi sull’uso del ctDNA per la diagnosi precoce.5,6

Sensibilità

Attualmente tutte le ricerche pubblicate riferiscono sensibilità calcolate da campioni raccolti in retrospettiva da pazienti con tumori di stadi differenti. I tumori sono stati invariabilmente diagnosticati con l’esame clinico o con la diagnostica per immagini. Precedentemente abbiamo calcolato le dimensioni del tumore, la quantità prevista di ctDNA in un campione di sangue di 10 ml, la frazione di ctDNA (percentuale di ctDNA rispetto al cfDNA totale, equivalente alla frazione allelica mutante, MAF), il numero di genomi recuperati su 10 ml di sangue e la probabilità di individuazione del tumore con l'analisi genomica del ctDNA. Abbiamo concluso che le attuali tecnologie ctDNA non sono in grado di rilevare tumori di diametro inferiore a 10 mm, perché non consentono di recuperare ctDNA sufficiente per l'analisi (errore di campionamento).5,6 Secondo dati sperimentali recenti dell'azienda GRAIL, l’analisi di pazienti asintomatiche con carcinoma mammario diagnosticato grazie allo screening mammografico mostra sensibilità solo del 10%. La sensibilità è significativamente più elevata (44%) quando si analizzano carcinomi mammari diagnosticati clinicamente.7

Specificità

Si identificano sempre più spesso mutazioni legate all'età nei tessuti normali,8 che possono compromettere la specificità dell'analisi cfDNA e generare risultati falsi positivi. Generalmente gli sperimentatori riferiscono le sensibilità con specificità del 95 o 98%,1,2,3 ma anche questi valori apparentemente elevati possono essere insufficienti per lo screening di tumori meno prevalenti, come il carcinoma ovarico e pancreatico. Ad esempio, un test con sensibilità del 100% e specificità del 99% darà un valore predittivo positivo (la probabilità che un paziente abbia il cancro se il test è positivo) solo del 2% se la prevalenza del cancro nella popolazione sottoposta a screening è 1:4.000.6

In genere, l'analisi del DNA libero non può indicare l'organo o il tessuto interessato in individui asintomatici, per cui un risultato positivo deve essere seguito da esami costosi, invasivi, stressanti e potenzialmente infruttuosi volti a identificare la lesione primaria. Cristiano et al. riferiscono una precisione del 61% per la localizzazione del sito tumorale, non molto diversa da quella ottenuta facendo testa o croce.3

Una nuova idea per l’analisi del cfDNA nella diagnosi del cancro

Recentemente, Cristiano et al. hanno impiegato la lunghezza di frammentazione e la posizione all'interno del genoma del DNA libero per diagnosticare il cancro attraverso il sequenziamento genomico a bassa profondità di diverse regioni da 5 megabasi,3 rilevando che il DNA libero di origine tumorale è generalmente più corto di circa 3-6 basi e che le lunghezze dei frammenti di origine tumorale mostrano una variabilità maggiore rispetto a quelle dei controlli.

In particolare, anziché studiare una sola o un ristretto numero di alterazioni genetiche osservate solo nel DNA tumorale, gli autori hanno impiegato l'intelligenza artificiale per esaminare lunghezza, variazione e posizione nell’intero spettro allo scopo di concludere se il pattern fosse tumorale o meno, riferendo sensibilità comprese tra il 57 e il 99% da 236 pazienti con vari tipi di cancro al 98% di specificità.

Restringiamo il campo: diagnosi di tumori precoci asintomatici

I nuovi test di rilevamento del cancro hanno il valore clinico più elevato se sono in grado di identificare la malattia a uno stadio iniziale asintomatico, quando le probabilità di guarigione sono massime. La sensibilità del saggio proof-of-concept di Cristiano et al. per la diagnosi dei tumori asintomatici in stadio iniziale (screening della popolazione) è sconosciuta, poiché sono stati utilizzati solo tumori diagnosticati all’esame clinico. Come dimostrato da GRAIL, la sensibilità variava a seconda che il rilevamento fosse avvenuto all’esame clinico o allo screening. Gli studi futuri con l’uso di questo test dovrebbero riferire sensibilità, specificità e valori predittivi positivi e negativi in modo da tener conto della prevalenza della malattia.

Un altro metodo per convalidare queste nuove tecnologie nel corso delle diagnosi di cancro, non ancora studiato su vasta scala, è forse quello di analizzare campioni raccolti longitudinalmente attraverso studi randomizzati, ma i primi risultati non si sono ancora mostrati promettenti. Il nostro gruppo ha recentemente utilizzato questo tipo di campioni per valutare e classificare 49 biomarcatori di carcinoma ovarico per la diagnosi preclinica di questo tipo di tumore.9 Abbiamo rilevato che nessuno di questi biomarcatori era efficace nell’individuare la malattia asintomatica, e che le prestazioni dei marcatori diminuivano man mano che i campioni venivano analizzati a maggiore distanza dalla diagnosi clinica. Marcatori come CA 125, con una sensibilità dell'80% nel rilevamento della malattia clinica, scendono a sensibilità inferiori al 50% in pazienti asintomatici. Gli studi futuri dovrebbero utilizzare campioni longitudinali per ottenere stime più realistiche del calcolo di sensibilità, specificità e anticipazione diagnostica (lead time) per l'individuazione del cancro tra lo stadio asintomatico e sintomatico.

L'importanza della frazione allelica mutante

Nei nostri calcoli precedenti, basati su dati sperimentali, abbiamo correlato la MAF al volume del tumore e recuperato genomi tumorali con un prelievo di sangue di 10 ml.5,6 Quando è presente meno di una copia di un ctDNA, miscelata con 10.000 copie di DNA normale (MAF dello 0,01% o inferiore), l'errore di campionamento (nessun recupero di ctDNA) rende impossibile il rilevamento del tumore. Con questa MAF il tumore avrà un diametro di ~12 mm. Nella maggior parte degli studi pubblicati, la MAF nei campioni è dello 0,1% o superiore. Con questa MAF il diametro del tumore sarà probabilmente superiore a 27 mm, facilmente rilevabile con la diagnostica per immagini.4,5

La MAF dei campioni utilizzati non è menzionata nell’articolo di Cristiano et al.;3 gli autori specificano solo una MAF inferiore all'1% in un sottoinsieme della coorte utilizzata. A livello teorico questo nuovo metodo potrebbe funzionare anche se nel campione è rappresentato meno di un genoma completo, poiché le informazioni sulla lunghezza dei frammenti derivano da una frazione delle regioni genomiche del DNA. Tuttavia, man mano che la MAF diminuisce, la capacità dell'algoritmo di intelligenza artificiale di prevedere il cancro si indebolirà progressivamente. Sono necessari ulteriori dati che pongano in correlazione MAF e sensibilità/specificità.

Conclusioni

L'articolo di Cristiano et al. è una dimostrazione di fattibilità e non affronta ancora in modo esaustivo le difficoltà associate alla diagnosi precoce del cancro. La sensibilità di questa nuova strategia e di altri metodi simili deve essere confermata in futuro da esperimenti che coinvolgano tumori con MAF nota. Occorre testare campioni pre-diagnostici per calcolare sia la sensibilità sia i tempi di esecuzione prima della diagnosi clinica, per determinare se l’anticipazione diagnostica ottenuta con il rilevamento precoce con ctDNA influenzi effettivamente gli esiti per il paziente.

Abbreviazioni

cfDNA: DNA libero circolante
ctDNA: DNA tumorale circolante
MAF: frazione allelica mutante

Bibliografia

1. Phallen J, Sausen M, Adleff V, Leal A, Hruban C, White J, et al. Direct detection of early-stage cancer using circulating tumor DNA. Sci Transl Med. 2017;9:eaan2415.
2. Cohen JD, Li L, Wang Y, Thoburn C, Afsari B, Danilova L, et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science. 2018;359:926–30.
3. Cristiano S, Leal A, Phallen J, Fiksel J, Adleff V, Bruhm DC, et al. Genome- wide cell-free DNA fragmentation in patients with cancer. Nature. 2019;570: 385–9.
4. Fiala C, Kulasingam V, Diamandis EP. Circulating tumor DNA for early cancer detection. J Appl Lab Med. 2018;(2) 036393.
5. Diamandis EP, Fiala C. Can circulating tumor DNA be used for direct and early stage cancer detection? F1000Res. 2017;6:2129.
6. Fiala C, Diamandis EP. Utility of circulating tumor DNA in cancer diagnostics with emphasis on early detection. BMC Med. 2018;16:166.
7. Liu MC, Maddala T, Aravanis A, et al. Breast cancer cell-free DNA (cfDNA) profiles reflect underlying tumor biology: the circulating cell-free genome atlas (CCGA) study. J Clin Oncol. 2018;36(15_suppl):536.
8. Tomasetti C. Mutated clones are the new normal. Science. 2019;364:938–9.
9. Cramer DW, Bast RC Jr, Berg CD, Diamandis EP, Godwin AK, Hartge P, et al. Ovarian cancer biomarker performance in prostate, lung, colorectal, and ovarian cancer screening trial specimens. Cancer Prev Res (Phila). 2011;4: 365–74.

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Traduzione italiana di Diana Lavarini - 26 settembre 2019 - RSC002